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            离心方法的选用
            点击次数:1442 发布时间:2009-09-23
            所分离的颗粒大小和密度相差较大:常速、高速离心;若从样品液中分离2种以上大小和密度不同的颗粒:差速离心;超速离心:差速离心法和密度梯度离心法,后者又分速率区带离心和等密度离心。
            1、  差速离心
            采用不同离心速度与时间,使不同沉降速度的颗粒分批分离;
            差速离心法:
            原理:采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心,使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批分离的方法,称为差速离心法。
            当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时,在离心管底部就会得到zui大和zui重颗粒的沉淀,分出的上清液在加上转速下再进行离心,又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”及含小和轻颗粒“上清液”,如此,多次离心处理,即能把液体中的不同颗粒较好分开。这时所得沉淀是不纯的,需经再悬浮和再离心(2—3次),才能得到较纯颗粒。
            常用于从组织匀浆中分离细胞和病毒。
            2、  密度梯度离心
            又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法;
            原理:不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
            介质梯度应预先形成,介质的zui大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油;
            密度梯度液的制备用梯度混合器,形成由管口到管底逐步升高的密度梯度;
            操作:离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面,离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带;
            可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。
            原理:当不同颗粒存在浮力密度差时,在离心力场下,在密度梯度介质中,颗粒或向下沉降,或向上浮起,一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带,从而使不同浮力密度的物质得到分离;
            区别:离心介质、密度梯度范围与密度梯度离心不同,欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内。
            介质有:氯化铯、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物等。
            操作:介质溶液与样品液混合均匀,足够时间离心。
            介质梯度不需预先制备,离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管,通过离心形成梯度,让颗粒在梯度中进行再分配。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
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